Тонкослойная хроматография (ТСХ) - вид жидкостной хроматографии, в котором подвижная фаза жидкая, а разделение происходит на слое сорбента, толщина которого существенно меньше его ширины [42, 43]. Адсорбционный слой с пленкой растворителя, удерживаемой сорбентом, служит неподвижной фазой, а индивидуальные растворители или смеси растворителей подвижной. Использование гранулированного сорбента дает методу преимущества перед бумажной хроматографией [44] из-за меньшего размывания пятен.

Разделение смесей производят на пластинках, покрытых тонким слоем (0,1-0,5 мм) адсорбента; оно основано на различии относительного сродства компонентов смеси к неподвижной фазе и осуществляется в результате перемещения подвижной фазы - элюента - под действием капиллярных сил. Чтобы избежать испарения элюента с поверхности сорбента, хроматографирование ведется в закрытых камерах различных типов, чем обеспечивается равновесие между подвижной жидкой фазой и ее парами [45].

Движение растворителя может происходить горизонтально, снизу вверх (восходящая), сверху вниз (нисходящая) или от центра к периферии (круговая или радиальная хроматография) [46]. Восходящая, нисходящая и круговая хроматография по технике выполнения может быть одномерной и двумерной. В последнем случае хроматографирование проводят дважды во взаимно перпендикулярных направлениях: после проявления хроматограммы одним элюентом ее поворачивают на 90° и вторично проявляют другим элюентом.

В зависимости от природы неподвижной фазы могут реализоваться следующие виды ТСХ полимеров:

• Адсорбционная ТСХ (АТСХ) основана на разделении макромолекул в соответствии с их адсорбционной активностью, возрастающей с увеличением молекулярной массы или доли адсорбционно-активных полярных групп (в случае сополимера). АТСХ с успехом используют для разделения гомополимеров по молекулярной массе и стереорегу-лярности, сополимеров по составу и типу чередования звеньев, для анализа ММР олигомеров с полным разделением на олигомергомологи, для определения функциональности олигомеров (когда их центральные звенья не адсорбируются),


• Преципитационная (осадочная) ТСХ (ПТСХ) основана на использовании в качестве элюента смеси растворителя с большим количеством адсорбционно-активного осадителя полимера. Разделение происходит вследствие изменения растворяющих свойств элюента по длине хроматографической пластинки. Это изменение может быть обусловлено тем, что на пластинку подается элюент изменяющегося состава (экстракционный вариант) или тем, что состав элюента изменяется непосредственно на пластинке в результате испарения и (или) уменьшения фазового отношения (отношения масс элюента и адсорбента).

Элементарный акт ПТСХ связан с разделением раствора полимера на разбавленную фазу, которая переносится с током растворителя, и концентрированную гель-фазу, которая осаждается на поверхности гранул адсорбента. ПТСХ реализуют только в отсутствие адсорбции полимера путем добавления растворителя к осадителю, причем элюент исходного состава должен содержать адсорбционно-активный компонент в концентрации, полностью предотвращающей адсорбцию полимера. ПТСХ используют для разделения синдио- и атактического полиметилметакрилата, отделения блоксополимеров от соответствующих гомополимеров, разделения гомополимеров и статистических сополимеров по молекулярной массе.

• Экстракционная ТСХ (ЭТСХ) основана на селективном растворении полимера в области стартового пятна по принципу "все или ничего". Используют однокомпонентный растворитель, который позволяет разделить в стартовом пятне полимерные фракции. С помощью ЭТСХ разделяют изо- и атактический полистирол и полиметилметакрилат, транс-1,4-, цис-1,4- и 1,2~полибутадиен, блок-сополимеры стирол - метилметакрилат и соответствующие гомополимеры.

• Тонкослойный электрофорез впервые был использован в 1946 году Конеденом для разделения аминокислот и пептидов. Преимуществами метода являются более эффективная система охлаждения, высокая чувствительность.

• Изоэлектрическая фокусировка - электрофорез на слое с градиентом рН. Амфолиты перемещаются по тонкому слою до тех пор, пока не достигнут такого места, где величина рН равна их изоэлектрической точке; в этом месте они концентрируются в виде резко очерченной зоны. Следовательно, можно не только разделять компоненты, но и определять их изоэлектрическую точку. Этим методом разделяются вещества, которые не удается разделить методом электрофореза; сочетание этих двух методов позволяет добиться прекрасных результатов. Метод приобрел практическое значение после описания Вестер-бергом и Свенсоном амфолитов, пригодных для получения градиента рН, и полезен в первую очередь биологам, изучающим ферменты, гормоны и др. амфолиты.

• Тонкослойная гельпроникающая хроматография (ТСГПХ) основана на молекулярно-ситовом эффекте, который может наблюдаться при двух условиях: подавлении адсорбционной активности адсорбента и заполнении его пор растворителем. Размер пор определяется степенью сшивания макромолекул в геле. Заполнение пор может быть достигнуто с помощью так называемой преэлюции - пропускания растворителя по пластинке перед нанесением пробы либо капиллярной конденсации при предварительном насыщении пластинки парами растворителя. Гель-фильтрация применяется для определения молекулярных масс разделенных компонентов, исследования ферментов, красителей, белков, ММР фракций полимеров.

5.5.1. Методика проведения анализа При проведении анализа наиболее широко применяются пластинки марки "silufol", имеющие стандартные характеристики закрепленного слоя и позволяющие получать воспроизводимые результаты. Используют 0,5-1 %-ные растворы испытуемого вещества или смеси веществ в легколетучем растворителе. Около 0,05 мл раствора пробы наносят микропипеткой в 10-20 мм от края пластинки в виде точек или коротких черточек (в одну точку на пластинке можно наносить до 1 мг раствора пробы). Затем растворителю дают испариться и пластинки устанавливают в камере для проявления в наклонном (под углом 10-15°) или вертикальном положении. Камерой может служить стеклянный сосуд с плоским дном, закрывающийся пришлифованной крышкой или стеклом. На дно камеры наливают столько растворителя, чтобы пластинка погружалась в него на 3-5 мм. С момента погружения пластинки в элюент возникает фронт смачивания, который перемещается по слою сорбента. При этом в токе элюента перемещаются также и исследуемые вещества со скоростью, зависящей от коэффициента адсорбции. К моменту, когда фронт элюента (граница увлажнения) достигает верхней части слоя сорбента, хроматографическое разделение заканчивается (на это требуется 50-90 мин). После этого пластинку вынимают из камеры, отмечают карандашом линию фронта, высушивают и детектируют пятна.

Вещества, имеющие окраску, обнаруживаются на хромато-грамме в виде отдельных пятен. В том случае, когда хроматографиру-ется бесцветное вещество, в зависимости от его природы поступают различным образом. Наиболее часто для проявления хроматограмм используют иод в виде паров или 1 %-ного раствора в метаноле. В первом случае пластинку помещают в эксикатор, насыщенный парами иода, во втором - обрызгивают раствором. Соединения появляются в виде коричневых пятен, а если смочить после этого поверхность пластинки водой, то на ней появляется контрастное фиолетовое изображение. Эффективным проявителем являются сильные окислители, например 50-98 %~ный раствор серной кислоты, 5-10 %-ный раствор азотной кислоты, 5-10 %-ный раствор бихромата натрия или калия в 50 %-ной серной кислоте. В этом случае после обработки пластинки раствором и нагревания в течение нескольких минут при 100-150 С соединения проявляются в виде черных пятен.

Универсальный способ детектирования разделенных веществ заключается в том, что при приготовлении пластинок к адсорбенту прибавляют неорганический фосфор и таким образом получают флуоресцирующие пластинки. Поскольку органические вещества чаще всего гасят флуоресценцию, то в ультрафиолетовом свете они обнаруживаются в виде темных пятен. Если вещества сами флуоресцируют, то под воздействием УФ~излучения они обнаруживаются в виде светлых пятен на темном фоне.

Возможно определение количества вещества непосредственно в хроматографическом пятне путем его сканирования точечным зондом. Так, при изучении состава сополимеров стирола с метилметакри-латом сканируют пятно с помощью ультрафиолетового детектора при длинах волн 225 и 265 нм; в этой области поглощают только стирольные фрагменты макромолекул.


Для этой цели на стартовую линию одной и той же пластинки наносят три пробы: одну с исследуемым веществом, вторую со стандартным образцом и третью - со смесью равных количеств исследуемого и стандартного вещества. Количество материала должно быть одинаковым во всех трех образцах. Если исследуемое вещество и стандартный образец идентичны по составу и строению, то все три пятна имеют одинаковую окраску и значение Rfi а хроматограмма смеси представляет собой одно пятно.

Значение Rf определяется тремя основными факторами: 1) природой элюента, вытесняющего адсорбированные на активных центрах молекулы исследуемых веществ, элюенпг выбирают таким образом, чтобы значение Rf исследуемых веществ находилось в пределах от 0,2 до 0,85;

2) степенью сродства вещества к адсорбенту; по мере увеличения числа функциональных групп энергия адсорбции возрастает (Rf уменьшается); внутримолекулярные взаимодействия, например водородные связи, наоборот, снижают способность вещества к адсорбции (R/ увеличивается).

3) свойствами сорбента, которые определяются не только химической природой вещества, но и микроструктурой его активной поверхности. В качестве сорбентов чаще всего используют оксид алюминия, силикагель, гипс гранулами размером 5-50 мкм.

5.5.2. Области применения метода ТСХ Впервые метод ТСХ был применен в 1889 г. голландским биологом Бейеринком, наблюдавшим диффузию капли смеси соляной и серной кислот по тонкому слою желатины; Измайлов и Шрайбер в 1938 г. при контроле подлинности лекарственных препаратов растительного происхождения применили тонкий слой оксида алюминия. Однако только после работ Е.Шталя, который в 1956 г. предложил стандартную методику, оборудование и сорбенты, метод начинает использоваться в исследовательской практике. Преимущества ТСХ -простота подготовки и малый расход пробы, разнообразие методов детектирования и низкая стоимость проведения анализа, универсальность - обеспечили его быстрое распространение [47].

ТСХ - один из наиболее простых и эффективных методов изучения состава смеси малолетучих и разлагающихся при нагревании органических соединений, а также установления степени их чистоты. Метод может быть использован для экспресс-анализа реакционных масс, т.е. слежения за течением химических реакций. ТСХ позволяет [48, 49] разделять полимерные фракции по молекулярной массе, по разветвленности, степени блочное™, регулярности и другим структурным особенностям макромолекул; оценивать неоднородность по составу сополимеров, поскольку адсорбционная активность макромолекул сополимеров зависит от их состава, особенно при сильных различиях в полярности сомономеров. Подбирая надлежащим образом пары растворитель - осадитель, можно добиться высокой разрешающей способности метода [50].

При анализе полимеров чаще всего возникают две задачи [51]: диагностика сополимера или разветвленного гомополимера и исследование их полидисперсности, а также определение присутствующих в сополимере гомополимеров. Эти задачи решают сравнением хрома-тографической подвижности анализируемых фракций полимера схроматографической подвижностью соответствующих линейных го-мополимеров в разных растворителях. Окончательная диагностика осуществляется либо путем обработки хроматограммы двумя проявителями, специфически окрашивающими гомополимеры разного типа (двойное окрашивание хроматографического пятна указывает на наличие сополимера), либо анализом состава полимера путем спектро-фотометрии непосредственно на пластинке или после элюирования зоны полимера с хроматографической пластинки.

Возможно использование комбинации хроматографических методов. Например, пятна, полученные в методе ТСХ, элюируют, концентрируют и анализируют методом газовой хроматографии. Таким способом проведено разделение витаминов, пестицидов, полярных углеводородов. При изучении блок- сополимеров вначале предварительно фракционируют макромолекулы по размерам с помощью гельпроникающей хроматографии, а затем по данным ТСХ оценивают долю гомополимеров в блок- сополимере и состав фракций.

Масс-спектрометрию и ТСХ можно комбинировать, непосредственно вводя в ионный источник пятна веществ, адсорбированных силикагелем [52]. Нанесение адсорбента на пластинки хлорида серебра позволяет записывать ИК-спектры непосредственно на пластинках; в работах с тонкими слоями целесообразно применение спектроскопии с многократным внутренним отражением.

Метод менее стандартизован и автоматизирован по сравнению с другими типами хроматографии, однако позволяет получать богатую, зачастую уникальную информацию. Первый полностью автоматизированный прибор для ТСХ был сконструирован и выпущен в продажу фирмой "Baker" в 1972 году, однако до сих пор используется ручной вариант ТСХ. Тем не менее современные методы ТСХ включают автоматизированное многократное проявление, проявление с ускорением потока подвижной фазы, сочетания с ВЭЖХ, электронной и инфракрасной спектроскопией, спектрометрией комбинационного рассеяния. Разработаны [53] программы библиотечного поиска по величинам RfH ультрафиолетовым спектрам,